C1 Gerlach

Forschungsbereich: ZooMAP
Status: In Arbeit

Projektleiter: Gerlach, Gerald-F.
Projektmitarbeiter: Weigoldt, Mathias; Heinzmann, Julia

Beschreibung:

Prof. Dr. med. vet. Gerald-F. Gerlach
Gesellschaft für Innovative Veterinärdiagnostik mbH (IVD)
Heisterbergallee 12
D-30453 Hannover

Zusammenfassung

Herr Prof. Gerlach ist seit dem 30.06.09 aus dem Dienst der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover ausgeschieden und seitdem in der Gesellschaft für Innovative Veterinärdiagnostik mbH in Hannover tätig. Administrativ und inhaltlich wird das Projekt und der es bearbeitende Doktorand, Herr Weigoldt, von Herrn Prof. Goethe und Herrn Dr. Meens betreut. Herr Gerlach ist weiter der „Doktorvater“ von Herrn Weigoldt und betreut als solcher seine Arbeiten von extern. Dieser Sachverhalt wurde dem DLR mitgeteilt und genehmigt. Im Vordergrund des Projektes steht die Charakterisierung der Proteinexpression von MAP im Wirt und die darauf aufbauende Ableitung der metabolischen Aktivität in vivo. Daneben sollen oberflächenassoziierte Antigene identifiziert und in E. coli exprimiert werden, um nachfolgend für FACS-Analysen und Immunhistologie geeignete Antikörper zu generieren. Zur Klärung dieser Fragen wurde eine beschriebene Methode zur Aufreinigung von MAP aus Darmmukosa verbessert und bei fünf Paratuberkulose-verdächtigen Kühen eingesetzt. Bei drei dieser Kühe wurde MAP isoliert; dabei lag die MAP-Feuchtmasse zwischen 1,3 und 5 % der Gesamtfeuchtmasse der Mukosa. Die Erreger wurden in Gesamtmembran und Zytoplasma fraktioniert; die Fraktionen wurden massenspektrometrisch mittels NanoACQUITY (UPLC)-gekoppelter MS-MS Analyse untersucht und mit entsprechenden Präparationen der in vitro-kultivierten Erregern verglichen. In den Membranen wurden 29 nur in vivo nachweisbare Proteine identifiziert. Die differentielle Expression wurde für einen Teil der Proteine über 2D-DIGE bestätigt. Für zwei der identifizierten Proteine (hemin-binding haemagglutinin [HBHA] und MAP_1775 wurde die kodierende Sequenz mit einer für die Expression in E. coli optimierten Kodonnutzung synthetisiert; die Umklonierung in einen Expressionsvektor für die nachfolgende Generierung spezifischer Antikörper ist in Arbeit. Die Analyse der MAP-Zytoplasma-Fraktion wird gegenwärtig durchgeführt. Zusätzlich zu den im Antrag beschriebenen Untersuchungen wurde ein MAP-Stamm konstruiert, der das rot-fluoreszierende Protein mCherry exprimiert; diese Arbeit wurde zwecks Erleichterung der Untersuchungen in den Teilprojekten C2 und C3 durchgeführt (die vorhandenen Antikörper erlaubten keine spezifische Erkennung von MAP in mikroskopischen Untersuchungen). Das Vorhabenziel MAP in für die Proteinanalytik ausreichenden Mengen aus Zentrifugenschlamm von Molkereien zu isolieren war nicht erfolgreich und wurde daher verworfen. Damit wurden trotz des hohen Schwierigkeitsgrades die für die Antragsjahre 1 und 2 vorgesehenen Ziele im Wesentlichen erreicht.

Fragestellungen und Ziele

Die ursprünglichen Ziele des Projektes waren
• die Identifizierung des MAP in-vivo-Proteoms und -metaboloms,
• die Expression rekombinanter MAP Proteine in E. coli und die Erstellung monoklonaler Antikörper,
• die Entwicklung einer Methode zur massenhaften Isolierung von MAP aus Milch (Zentrifugenschlamm) und
• die Untersuchung der metabolischen Aktivität von MAP nach der Pasteurisierung.
Wie auch aus der Bewilligung einer Nano-ACQUITY UPLC-Anlage durch den Projektträger zu ersehen ist, stand dabei die Identifizierung des MAP in vivo Proteoms klar im Fokus des Projektes. Da sich in den ersten Monaten des Projektes zeigte, dass die Spezifität der verfügbaren MAP-spezifischen Antikörper für die konfokale Mikroskopie nicht zufriedenstellend war, wurde zusätzlich ein rekombinanter MAP erstellt, der das rot-fluoreszierende mCherry-Protein exprimiert.